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2007-06-25 | 脂质体在生物领域内的研究进展
吴小宁1，王 军2，欧阳五庆1
（1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨陵 712100；2.陕西亨通光华有限公司，陕西西安 710068）
摘 要：从Allison首次报道脂质体具有免疫佐剂效应以来，脂质体在生物领域的研究取得了很大的进展,目前已成为生物领域内的一项高新技术。脂质体作为基因载体主要被应用于基因转染和基因组功能研究，并取得了较大的成绩。作为一种新的药物剂型，脂质体在生物药品的制剂技术中得到了广泛的应用，它除了用做疫苗的佐剂之外，还被用作激素类、多肽类、酶类等药物的载体，从而开辟了生物药制剂技术的新时代。尽管脂质体这种新技术在生物领域内具有极其广阔的应用前景，但脂质体在该领域的研究应用中存在着较多的技术难题。文章对脂质体在生物领域内的研究进展进行了详尽的叙述，可为脂质体在生物领域内的进一步研究提供参考。
关键词：脂质体；基因治疗；生物药品
脂质体（liposome）是一种将药物包封于类脂双分子层中所形成的超微型球状载体制剂[1]，是一种定向药物载体，属于靶向给药系统。由Bangham Y[2]于20世纪60年代中期提出，迄今已经在生物物理学、治疗物理学、化学、胶体学等各种科学领域中广泛应用，并且脂质体作为药物传递系统已广泛地应用于临床。目前关于脂质体在医药领域内的研究开发主要集中在三个方面：①用做核酸类药物及核酸类物质的载体[3]；②用做蛋白质多肽类的载体以及蛋白质多肽类疫苗与DNA疫苗的载体；③用来包裹抗肿瘤的化疗药物。本文主要从作为基因载体和生物药物运载系统对脂质体在生物领域内的研究进展进行了综述。
1 脂质体作为基因载体的研究
1.1 脂质体作为基因载体的特点
近年来，随着生物技术的不断发展，脂质体制备技术的不断完善，脂质体作为基因工程载体的研究应用已经取得了一定的进展，为细胞工程及遗传工程提供了一种新的载体，这种新的载体具有以下几个优点：易于制备，使用方便，对于所携带的载体材料没有严格的限制，如可以携带DNA、RNA、染色体、病毒甚至某些细胞器，且该类载体对受体也没有选择性；可防止核酸被体内物质降解，可将其特异性传递到靶细胞中；该新型载药系统还具有低剂量、高效性、低毒性、定位性、缓慢释放、无免疫原性等多种优点；在基因转染技术中，基因转染效率高，100%离体细胞可瞬间表达外源基因。同济医科大学附属协和医院眼科的徐莉莉等人[4]通过在体外培养的视网膜色素上皮细胞中将无脂质体介导的裸反义寡核苷酸（AS-DN）与用脂质体介导的AS-DN进行转染发现，与无脂质体介导裸AS-DN相比，脂质体介导AS-N在胞浆、尤其是在胞核的分布明显加强；不仅转染速度快，而且在细胞的存留时间至少延长1倍以上，从而证明脂质体能明显增强AS-DN在RPE的转染效率，有望进一步用于PVR治疗的研究。
1.2 脂质体在基因转染技术中的研究与应用
随着脂质体技术的不断完善，生物技术的不断发展，脂质体作为基因载体的研究也取得了长足的发展。脂质体作为基因载体主要被用于基因治疗和基因组功能研究这两个大的方面。
（1）脂质体在基因治疗方面的研究与应用。基因治疗是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定的方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。在基因治疗过程中，用于基因输送的脂质体包括阳离子和阴离子型脂质体两种,但阳离子型脂质体更常用,它可以通过电荷的作用吸附并载带基因，因而基因治疗用脂质体多为阳离子型脂质体，1987年Felgner等首次用人工合成的阳离子脂质体N-1 (2，3-二油酰氧)丙基〕-N-1-N-1-N-氧化三甲铵(DOTMA)构建小单层脂质体，与DNA自发作用形成脂质体DNA复合物，促进了DNA的细胞摄入和胞内的稳定表达。进一步研究发现有中性磷脂参与构成的阳离子脂质体活性更强。而Lip即是由阳离子脂质(DOTMA)和中性磷脂二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE合成的脂质体，适用于将各种核酸导入培养的细胞内。其机理是阳离子脂质体通过静电引力作用与带负电荷的核酸自发形成复合物，净电荷为正的复合物又很容易结合到带负电荷的细胞表面，与细胞融合，通过细胞内吞作用进入胞内。因此，它与传统脂质体不同，并非将核酸包入脂质体囊内，而是结合到表面，只需混合即可俘获几乎100%的核酸，而传统脂质体的核酸包裹率不到10%。与硫酸钙共沉淀法或二乙氨乙基(DEAE)葡聚糖方法相比，应用Lip的核酸转染效率要高出5倍～100倍。因此，阳离子脂质体应用方便，优势明显，近几年被广泛用于将DNA，RNA和蛋白质导入活细胞。但关于应用此类脂质体介导相对小分子的ASODN转染活细胞的报道罕见。
1989年Stoolman研究发现，DOTMA可使细胞摄入ASODN的量增加10倍以上，而且因为显著改变了其在细胞内的情况使ASODN的生物活性增强了100倍。1991年Chiang等首次在哺乳动物细胞中证实阳离子脂质体可使ASODN的作用明显增强。1994年Nestle等将Lip与靶向细胞间粘合分子1(ICAM1)mRNA的ASODN混合后作用于角细胞，使ICAM-1的表达减少50%，而无Lip介导时仅减少30%。同时也表明人DNA polαmRNA特异的ASODN在Lip介导下抑制人肝癌细胞增殖的作用增强了10倍。因此，Lip可望成为简单有效的运载工具，介导ASODN进入体外培养或体内细胞，解决细胞摄入困难的问题。目前在美国实施的基因治疗方案中阳离子型脂质体介导的基因传递系统占12项。其优点有：①制备与使用方法简单；②可携带大片段DNA乃至整个染色体；③可容纳疏水性及亲水性物质；④能与100%DNA形成复合物；⑤消除了危险重组于形成的可能性；⑥通用于各种类型的裸露DNA或RNA；⑦能转染各种类型的细胞，转染率较高；⑧没有免疫原性。基因治疗目前主要是治疗那些对人类健康威胁严重的疾病，包括遗传性疾病（如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病（AIDS、类风湿等）。
脂质体在基因治疗方面目前仅处于初步研究阶段，如苏君等[5]进行了阳离子脂质体介导HSVTK基因治疗人脑胶质瘤的实验研究，并取的了一定的进展。据报道，帝京大学丸山一雄率领的研究小组日前开发出了将药物集中投放到某一特定部位的药物输送系统（DDS），DDS新技术中使用通过化学修饰而提高了性能的“智能脂质体”，其直径为100 nm左右。通过在这个球形分子膜内载入基因治疗DNA分子水溶液，可使药物更容易到达癌变部位的细胞，并顺利被吸收，该DDS针对癌症等病症的基因治疗效果可提高到20倍以上，有时甚至还能获得100倍以上的效果。邢诒刚等[6]进行了阳离子脂质体介导芳香族氨基酸脱羧酶（AADC）基因重组体脑内直接注射治疗帕金森病的实验研究，探讨了芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)基因脑内移植对帕金森病的治疗作用及其在左旋多巴(Ldopa)治疗过程中的地位,并探讨阳离子脂质体介导的基因治疗方法的有效性，阳离子脂质体介导的裸基因脑内移植技术为基因治疗帕金森病提供了一种手段。脂质体介导的血管生长因子治疗缺血性疾病是有效的。在后肢缺血的兔子模型中, 阳离子脂质体介导的VEGF基因转染,使患肢血管生长,血流增加。实验证明,脂质体介导的HGF基因治疗同样有效。Jeschke M G[7]等利用阳离子脂质体转染IGF-1基因，用于小鼠全层皮肤烧伤模型的治疗，将重组体皮下注射后，对比只注射IGF-1，皮肤创面的IGF-1水平明显升高，促进了创面愈合。李芳[8]等通过对转染条件的分析,提高阳离子脂质体介导的肺癌细胞基因转染效率,为其进一步用于肺癌的基因治疗打下基础。刘世喜等[9]阳离子脂质体介导白细胞介素2基因治疗头颈鳞癌的初步实验研究。表达scFv M97抗体基因的真核表达载体, 利用阳离子脂质体LipofectAMINE介导scFv M 97因转染, 对人高转移性肺巨细胞癌系PG进行基因治疗研究, 结果表明, 细胞内表达scFv M97对PG细胞型胶原酶分泌PG细胞。Randal等应用转铁蛋白聚L赖氨酸配体聚阳离子脂质体复合物转染TGF-β1基因入原代软骨膜细胞及软骨细胞，效率可达到70％，植入骨软骨缺损模型中，1周后缺损处仍有TGF-β1表达，虽然在植入物核心的细胞无法表达β-gal酶，但可引起细胞增殖的变化。
（2）脂质体在基因组功能研究方面的研究与应用。在基因组功能研究方面，脂质体主要被应用于基因表达调控、基因功能、信号转导、药物筛选等方面，如戴大英等[10]通过脂质体介导P53基因，探讨了该基因对人肝癌细胞端粒酶活性的影响。从而进一步为抗癌药物的选择鉴定了基础。目前，脂质体在转基因技术领域也有了一定了的应用，主要应用在动物基因转移的胚胎干细胞法中。内蒙古大学实验动物研究中心已经成功地通过脂质体（FUGENE-6）介导将真核表达载体PEGFP-CL成功的导入体外培养的牛胎儿成纤维细胞中，并且还进一步对脂质体介导外源基因的条件进行了优化[11]。
2 脂质体作为生物药品运载系统的研究
2.1 脂质体作为生物药品运载系统的特点
脂质体作为生物医药产品新剂型已经得到了广泛的应用，目前脂质体已被用于细胞因子类药物、酶、多肽类药物、疫苗以及免疫诊断等领域[12]。脂质体作为生物药品新剂型具有以下的优点：①可以避免传统工艺中引起酶、蛋白和肽类药物的失活的一些制备条件，如加热和有机溶剂等条件；②脂质体保护了被包封的酶、蛋白和肽类等药物使其稳定性增强，并且脂质体还保护了这类药物免受体内酶的分解而使其在体内的半衰期延长；③ 降低药物的毒副作用，尤其可以减轻这类产品中污染源及异体蛋白引起的急性过敏性反应；④提高机体的免疫功能与药物产生协同效应；⑤脂质体的作用机制使得该类药物具有细胞靶向性从而提高治疗指数和生物利用度。
2.2 脂质体作为生物药品运载系统的研究
脂质体作为当今生物药品新剂型领域内的高新技术之一，已经被广泛的应用于药物运载系统、药剂改革及靶向性药物等方面研究。目前，抗肿瘤药、激素类药物、核酸类药物、反义药物、细胞分子、多肽及蛋白质以及疫苗大都采用脂质体方式给药。估计在生物药物市场上将有较大的发展。因而我们对这方面的内容进行概述以供参考。
（1）激素类药物的载体。脂质体作为激素类药物的载体已经得到了一定的应用，并具有一定的优越性，如抗炎甾醇类激素包入脂质体后具有很大的优越性：浓集于炎症部位便于被吞噬细胞吞噬；避免游离药物与血浆蛋白作用，一旦到达炎症部位，就可以内吞、融合后释药，在较低剂量下便能发挥疗效，从而减少甾醇类激素因剂量过高引起的并发病和副作用。吴振国等[13]已经通过薄膜法成功的制备了猪用生长激素（PST）。郭建新等[14]已经成功的研制了胰岛素柔性脂质体并对其的将血糖效果在小鼠上进行了实验。
（2）多肽及酶类药物的载体。多肽、酶类药物都是生物大分子，其共同特点是在生物体内不稳定，易于被蛋白水解酶降解，因而在生物体内的半衰期较短，而且绝大部分不利于口服给药。如超氧化物歧化酶(SOD)能清除体内过量的超氧阴离子自由基损伤，体内易于被蛋白酶水解破坏，当用脂质体包裹后，在生物体内的半衰期明显提高，而且脂质体能增加细胞对SOD的摄取能力，从而能更好地保护细胞免受自由基损伤。Amderson等研究表明皮下注射游离IL-2的半衰期仅为6 min，而脂质体包裹的IL-2为68 min，且脂质体包裹的IL-2体内分布和药物代谢动力学发生很大改变。胰岛素口服后由于胃酶和胃酸的破坏作用，生物利用度低，而用脂质体包裹后，可克服这些缺点，口服后动物血糖下降明显。脂质体的天然靶向性使包封酶的脂质体主要被肝所摄取。脂质体是治疗酶原贮积病药物最好的载体，有人应用包封淀粉-葡萄糖酶的多室脂质体治疗Ⅱ型糖原贮积病，使患者肝大明显缩小。另外，脂质体也被用来治疗其它酶系统疾病，并取得很好的效果。毛孙忠等[15]研究了L-精氨酸脂质体对慢性低O2高CO2肺血管L精氨酸转运的影响。并且已经研制出了几种较好的生物制品，如人降钙素基因相关肽脂质体各种剂型的研制成功。
（3）疫苗的载体。1974年，Allison等首次报道用脂质体的免疫佐剂效应。1990年，Wolf等在把阳离子脂质体包装的重组质粒注入小鼠肌肉进行基因治疗试验时，以裸露的DNA作为对照。意外发现裸露的DNA也能被小鼠的骨骼肌细胞吸收，并在小鼠的注射部位产生了外源蛋白质，而且小鼠对这种外源蛋白质产生了专一的免疫反应。1992年，Tang等将含有人生长激素基因的质粒导入小鼠表皮细胞后，在小鼠的血清中检测到抗人生长激素的抗体。因此，基因疫苗的出现，开辟了疫苗的新途径，也标志着疫苗第三次革命的到来。Iinuna(1995)用MDP脂质体包裹流感病毒H3N2，免疫小鼠后，小鼠脾细胞可明显降低转移至小鼠肺中的病毒滴度，表明MDP脂质体疫苗可通过增强细胞免疫来保护小鼠抵抗流感病毒攻击。Childers等将变异链球菌中的葡萄糖基转移酶(GTF)脂质体制成肠溶型胶囊，给7名健康成人口服每人每天500 μg，连用3 d，28 d后再加强1次，结果5人的腮腺分泌物中抗GTF的IgA1和IgA2水平增加，第35天时达高峰，表明脂质体疫苗经口服后可诱导机体产生分泌型IgA抗体。脂质体作为疫苗佐剂可同时增强机体的体液免疫和细胞免疫。
3 脂质体在其他领域内的应用
随着生物技术的不断发展，脂质体也相继被用于化妆品和食品等领域，并取得了一定的进展。目前，在食品领域脂质体主要被用在以下几个方面：①加速奶酪的早熟；②在奶酪中防止微生物的腐败；③防止乳状食品氧化；④作为酶反应器。脂质体作为一种新剂型在化妆品领域内也得到了广泛的应用，目前已经有相关的脂质体化妆品在市面上销售。脂质体化妆品因具有细胞膜的某些特性，因而极易为皮肤所吸收，脂质体也是化妆品发展的一个趋势和方向。
4 问题和展望
近半个世纪以来，尽管脂质体在较多的领域内得到了较大的发展，取得了长足的发展，目前，这种新剂型也应用在了临床治疗中，但这种新剂型还存在着一些亟待解决的问题。大量的研究工作证实，在基因治疗方面，脂质体与裸DNA相比，脂质体基因导入方法能提高局部基因导入率。但是距特异高效介导基因转移这一目标仍有很大差距，有待于进一步提高。脂质体这种新剂型的稳定性比较差，这也是我们需要进一步研究和考虑的问题。
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Progress on Liposome in Biological Area
WU Xiao-ning1,WANG Jun2,OUYANG Wu-qing1
（1.College of Animal Science and Technology,Northwest A & F University,Yangling,Shaanxi,712100，China;2.Shannxi Xi'an Hengtong Guanghua Limited Company,Xi'an，Shaanxi,710068,China）
Abstract: Since Allison found that the liposome has the effect of immunological adjuvant first time,liposome has made considerable progress and development. Now liposome has become a kind of hightechnologies in biological area.As the gene transfer ,liposome has mainly been applied in research on gene transfection and research on function of genome.Liposome has made considerable progress and development in those two area. As the new medicationadjuvant,liposome has been widely applied in medication technology.In these area, liposome has mainly been used as the carriers of peptides.enzyme,hormone besides as the immunological adjuvant.This new technology pioneers the new era of medicationadjuvant.Although liposome has made considerable progress and development in the biological area,there are many technological tough problems have not been tackled.This article described the progress on liposome in biological area in order to provide some references for researchers who devote themselves to research on liposome in biological area.
Key words: liposome；gene therapy；biopharmaceutical
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