生物技术疫苗是利用生物技术制备的分子水平的疫苗，包括基因工程亚单位疫苗、合成肽疫苗、抗独特性疫苗、基因工程活疫苗、DNA疫苗以及转基因植物疫苗。
（一） 基因工程亚单位疫苗（genetic engineering subunit vaccine）  基因工程亚单位疫苗是用DNA重组技术，将编码病原微生物保护性抗原的基因导入受体菌（如大肠杆菌）或细胞，使其在受体细胞中高效表达，分泌保护性抗原肽链。提取保护性抗原肽链，加入佐剂即制成基因工程亚单位疫苗。首次报道成功的是口蹄疫基因工程疫苗，此外还有预防仔猪和犊牛下痢的大肠杆菌菌毛基因工程疫苗。
（二） 合成肽疫苗（synthetic peptide vaccine） 合成肽疫苗是用化学合成法人工合成病原微生物的保护性多肽并将其连接到大分子载体上，再加入佐剂制成的疫苗。最早报道（1982）成功的是口蹄疫疫苗。合成肽疫苗的优点是可在同一载体上连接多种保护性肽链或多个血清型的保护性抗原肽链，这样只要一次免疫就可预防几种传染病或几个血清性型。目前研制成功的合成肽疫苗还不多，但越来越受到人们的重视，相信该类疫苗在未来的生产实践中能发挥重要的作用。
（三） 抗独特型抗体疫苗（antiidiotype antibody vaccine） 抗独特型抗体疫苗是免疫调节网络学说发展到新阶段的产物。网络学说认为，生物体对抗原的免疫答应是通过独特型（ID）与抗独特型（Anti-Id）之间的反应而调节的。独特型是指与某一抗原免疫
应答有关的，能与抗原发生特异性反应的一组细胞（T、B细胞克隆）及其因子（T细胞因子和抗体）所具有的抗原特异性，在正常情况下，机体的Id处于极低水平，当机体受到抗原刺激时，T、B淋巴细胞增殖、抗体水平升高，相应的Id水平也升高，继而刺激Anti-Id（Ab2）的产生，Anti-Id的产生又可刺激Anti-anti-Id（Ab）的产生。如此循环下去，构成对原始应答的复杂免疫调节网络。当抗原与Ab1结合后，可以阻碍Ab2与Ab1上的Id结合 ，因而说明Ab2能识别Ab1的抗原结合部位。Ab2β模拟抗原，可刺激机体产生与Ab1具有同等免疫效应的Ab3由此制成的疫苗称为抗独特型疫苗或内影像疫苗。抗独特型疫苗不仅能诱导体液免疫，亦能诱导细胞免疫，并不受MHC的限制，而且具有广谱性，即对易发生抗原性漂变的病原能提供良好的保护力（见图23-2）。 单抗技术以及“独特型网络”的发现意味着Ig可被用作“替代”抗原。对糖类和脂类抗原来说，这一方法可以制造一个“蛋白质拷贝”，而蛋白质作为疫苗具有某些优点。
（四）基因工程活疫苗（genetic engineering live vaccine） 基因工程活疫苗包括基因缺失疫苗和活载体疫苗二类。
1. 基因缺失疫苗（gene defect vaccine）  是用基因工程技术将强毒株毒力相关基因切除构建的活疫苗，该苗安全性好、不易返祖；其免疫接种与强毒感染相似，机体可对病毒的多种抗原产生免疫应答；免疫力坚强，免疫期长，尤其是适于局部接种，诱导产生黏膜免疫力，因而是较理想的疫苗。目前以有多种基因缺失疫苗问世，例如霍乱孤菌A亚基基因中切除94%的A1基因，保留A2和全部B基因，再与野生菌株同源重组筛选出基因缺失变异株，获得无毒的活菌苗；将大肠杆菌LT基因的A亚基基因切除，将B亚基基因克隆到带有粘着菌毛（K88，K99，987P等）大肠杆菌中，制成不产生肠毒素的活菌苗。另外，将某些疱疹病毒的Tk基因
切除，其毒力下降，而且不影响病毒复制并有良好的免疫原性，成为良好的基因缺失苗。
2. 活载体疫苗（live vector vaccine）  是用基因工程技术将保护性抗原基因（目的基因）转移到载体中使之表达的活疫苗。目前有多种理想的病毒载体，如痘病毒、腺病毒和疱疹病毒等都可以用于活载体疫苗的制备。痘病毒的TK基因可插入大量的外源基因，大约能容纳25Kb，而多
数的基因都在2Kb左右，因此可在TK基因中插入多种病原的保护性抗原基因。制成多价苗或联苗，一次注射可产生针对多种病原的免疫力。国外已研制出以腺病毒为载体的乙肝疫苗、以疱疹病毒为载体的新城疫疫苗等。活载体疫苗具有传统疫苗的许多优点，而且又为多价苗和联苗的生产开辟了新路，是当今与未来疫苗研制与开发的主要方向之一（见图23-3）。
（五） DNA疫苗（DNA vaccine）这是一种最新的分子水平的生物技术疫苗，应用基因工程技术把编码保护性抗原的基因与能在真核细胞中表达的载体DNA重组，这种目的基因与表达载体的重组DNA可直接注射（接种）到动物（如小鼠）体内，目的基因可在动物体内表达，刺激机体产生体液免疫和细胞免疫。
（六）转基因植物疫苗（transgenic plant vaccine） 该苗用转基因方法将编码有效免疫原的基因导入可食用植物细胞的基因中，免疫原即可在植物的可食用部分稳定的表达和积累，人类和动物通过摄食达到免疫接种的目的。常用的植物有番茄、马铃薯、香蕉等。如用马铃薯表达乙型肝炎病毒表面抗原已在动物试验中获得成功。这类疫苗尚在初期研制阶段，它具有口服、易被儿童接受等优点。

中华人民共和国农业部令
第3号
　　《兽用生物制品经营管理办法》已于2007年2月14日经农业部第3次常务会议审议通过，现予发布，自2007年5月1日起施行。
附件：兽用生物制品经营管理办法
　　部长 孙政才
　　二〇〇七年三月二十九日

兽用生物制品经营管理办法

　　第一条为了加强兽用生物制品经营管理，保证兽用生物制品质量，根据《兽药管理条例》，制定本办法。
　　第二条在中华人民共和国境内从事兽用生物制品的分发、经营和监督管理，应当遵守本办法。
　　第三条兽用生物制品分为国家强制免疫计划所需兽用生物制品（以下简称国家强制免疫用生物制品）和非国家强制免疫计划所需兽用生物制品（以下简称非国家强制免疫用生物制品）。
　　国家强制免疫用生物制品名单由农业部确定并公告。
　　第四条农业部负责全国兽用生物制品的监督管理工作。
　　县级以上地方人民政府兽医行政管理部门负责本行政区域内兽用生物制品的监督管理工作。
　　第五条国家强制免疫用生物制品由农业部指定的企业生产，依法实行政府采购，省级人民政府兽医行政管理部门组织分发。
　　发生重大动物疫情、灾情或者其他突发事件时，国家强制免疫用生物制品由农业部统一调用，生产企业不得自行销售。
　　农业部对定点生产企业实行动态管理。
　　第六条省级人民政府兽医行政管理部门应当建立国家强制免疫用生物制品储存、运输等管理制度。
　　分发国家强制免疫用生物制品，应当建立真实、完整的分发记录。分发记录应当保存至制品有效期满后2年。
　　第七条具备下列条件的养殖场可以向农业部指定的生产企业采购自用的国家强制免疫用生物制品，但应当将采购的品种、生产企业、数量向所在地县级以上地方人民政府兽医行政管理部门备案：
　　（一）具有相应的兽医技术人员；
　　（二）具有相应的运输、储藏条件；
　　（三）具有完善的购入验收、储藏保管、使用核对等管理制度。
　　养殖场应当建立真实、完整的采购、使用记录，并保存至制品有效期满后2年。
　　第八条农业部指定的生产企业只能将国家强制免疫用生物制品销售给省级人民政府兽医行政管理部门和符合第七条规定的养殖场，不得向其他单位和个人销售。
　　兽用生物制品生产企业可以将本企业生产的非国家强制免疫用生物制品直接销售给使用者，也可以委托经销商销售。
　　第九条兽用生物制品生产企业应当建立真实、完整的销售记录，应当向购买者提供批签发证明文件复印件。销售记录应当载明产品名称、产品批号、产品规格、产品数量、生产日期、有效期、收货单位和地址、发货日期等内容。
　　第十条非国家强制免疫用生物制品经销商应当依法取得《兽药经营许可证》和工商营业执照。
　　前款规定的《兽药经营许可证》的经营范围应当载明委托的兽用生物制品生产企业名称及委托销售的产品类别等内容。经营范围发生变化的，经销商应当办理变更手续。
　　第十一条兽用生物制品生产企业可以自主确定、调整经销商，并与经销商签订销售代理合同，明确代理范围等事项。
　　第十二条经销商只能经营所代理兽用生物制品生产企业生产的兽用生物制品，不得经营未经委托的其他企业生产的兽用生物制品。
　　经销商只能将所代理的产品销售给使用者，不得销售给其他兽药经营企业。
　　未经兽用生物制品生产企业委托，兽药经营企业不得经营兽用生物制品。
　　第十三条养殖户、养殖场、动物诊疗机构等使用者采购的或者经政府分发获得的兽用生物制品只限自用，不得转手销售。
　　第十四条县级以上地方人民政府兽医行政管理部门应当依法加强对兽用生物制品生产、经营企业和使用者监督检查，发现有违反《兽药管理条例》和本办法规定情形的，应当依法做出处理决定或者报告上级兽医行政管理部门。
　　第十五条各级兽医行政管理部门、兽药检验机构、动物卫生监督机构及其工作人员，不得参与兽用生物制品的生产、经营活动，不得以其名义推荐或者监制、监销兽用生物制品和进行广告宣传。
　　第十六条养殖户、养殖场、动物诊疗机构等使用者转手销售兽用生物制品的，或者兽药经营者超出《兽药经营许可证》载明的经营范围经营兽用生物制品的，属于无证经营，按照《兽药管理条例》第五十六条的规定处罚。
　　第十七条农业部指定的生产企业违反《兽药管理条例》和本办法规定的，取消其国家强制免疫用生物制品的生产资格，并按照《兽药管理条例》的规定处罚。
　　第十八条本办法所称兽用生物制品是指以天然或者人工改造的微生物、寄生虫、生物毒素或者生物组织及代谢产物等为材料，采用生物学、分子生物学或者生物化学、生物工程等相应技术制成的，用于预防、治疗、诊断动物疫病或者改变动物生产性能的兽药。
　　本办法所称非国家强制免疫用生物制品是指农业部确定的强制免疫用生物制品以外的兽用生物制品。
　　第十九条进口兽用生物制品的经营管理适用《兽药进口管理办法》。
　　第二十条本办法自2007年5月1日起施行

吴淑勤* 李宁求 李凯彬 巩华 黄志斌 潘厚军 张敏

（中国水产科学研究院珠江水产研究所，广东广州，510380）

【摘要】 本文对涉水人体疫病及水环境有害因子对人体健康的影响作一简要介绍，综述了水生实验动物在人类疾病研究及环境检测方面的研究进展。 探讨了以水生生物为材料进行涉水人体公共卫生研究的应用前景。

【关键词】水生生物；人体公共卫生；人畜共患病；实验动物

　　1946年

　　六价疫苗取得许可证，但是被抗细菌制剂取代。

　　1964～1968年

　　有效化学治疗方法无法防止死亡，重新进行疫苗研究。

　　1977年

　　14价疫苗获得许可证。

　　1984年

　　23价疫苗获得许可证。

　　嗜血杆菌疫苗

　　1985年

　　较大的儿童使用多糖疫苗获得许可证，多糖疫苗在较小儿童免疫性不足。

　　1987～1990年

　　不同的嗜血杆菌结合疫苗获得许可证。

　　1992年

　　对所有多糖疫苗进行广泛地研究。

　　1998年

　　史克美占公司获得新型次单元莱姆疫苗的许可证。

　　麻疹疫苗

　　鸡胚细胞培养。 减少反应，与免疫球蛋白同时使用。

　　进一步减毒(无球蛋白)。 由培养液中去除鸡白血病病毒，研发实验性无白血病鸡群。???? 高度有效性和安全性疫苗产生。

　　腮腺炎疫苗

　　鸡胚细胞培养。无神经毒性的Jerry Lynn病毒株　高效价和无反应的疫苗生成。

　　德国麻疹疫苗

　　发现在鸭细胞中繁殖。

　　快速及可靠的减毒作用。

　　不会对容易感染的成年接触者传播。

　　两价和三价配方

　　可接受的效价和反应生成性。

　　临床试验极为成功。

　　主要的小儿免疫原。

　　水痘疫苗

　　1981年KMcC病毒株制出。应用减毒程序时，病毒无法达到可接受的反应性与免疫生成性间的平衡点。由OKA病毒株取代。

　　疫苗的种类

　　1、死疫苗：用物理或化学的方法将病原微生物杀死制备而成的制剂，称为死疫苗。

　　种类：伤寒、霍乱、百日咳、流脑、乙脑、斑疹伤寒及钩体等疫苗。

　　特点：免疫作用弱，必须多次注射，并且量要大。但易保存。

　　2.活疫苗：用人工变异或从自然界筛选获得的减毒或无毒的活的病原微生物制成的制剂，称为活疫苗，又称减毒活疫苗。

　　种类：卡介苗、麻疹、脊髓灰质炎疫苗、风疹等疫苗。

　　特点：免疫作用强，接种量小，一般只需接种一次。但稳定性差，不易保存。

　　3.亚单位疫苗：提取病原微生物中能刺激机体产生保护性免疫的抗原成分制备而成的疫苗。如乙型肝炎血源性疫苗，是分离纯化乙型肝炎病毒小球形颗粒HbsAg而制成的。

　　4.合成疫苗：将能诱导机体产生保护性免疫的人工合成的抗原肽结合于载体上，再加入佐剂而制成的疫苗。需要首先获得有效成分的氨基酸序列。

　　特点：一旦合成可大量生产，且无血源性传染的可能性。

　　5.基因工程疫苗：将病原微生物中编码诱导保护性免疫的抗原基因(目的基因)与载体重组后导入宿主细胞，目的基因的表达产生大量相应抗原，由此制备的疫苗称为基因疫苗。如乙肝基因疫苗。

　　6.类毒素：细菌外毒素经0.3%～0.4% 甲醛处理后，使其失去毒性，保留抗原性，即成类毒素。

　　种类：白喉、破伤风类毒素等。

摘  要：在水产养殖中，微生物多糖是被广泛研究和应用的免疫增强剂。不同结构的多糖产生的免疫增强效果不同，葡聚糖的初级结构、螺旋构象、分支情况、分子量大小和取代基团的性质都是影响葡聚糖免疫活性的因素；肽聚糖的分子量大小和二糖寡肽保守重复结构，尤其是肽段部分的结构是影响肽聚糖免疫活性的主要因素；脂多糖的免疫活性主要与类脂A的结构有关，而影响类脂A活性的因素有二糖骨架、磷酸化所决定的负电荷分布状态以及脂酰基的性质、长度和数量。

关键词：微生物多糖；葡聚糖；肽聚糖；脂多糖；免疫增强活性

由于大多数水产动物不具有发达的特异性免疫系统，微生物多糖作为非特异性免疫增强剂来抵抗微生物感染，已为人们所认同。如何利用多糖来提高水产养殖动物的免疫力已成为研究的热点。由于来源、材料和提取方法的不同，可导致微生物多糖的细微结构存在差异，而其分子结构正是决定其免疫活性的关键所在。

1 微生物多糖的种类及其免疫活性

微生物多糖主要来源于细菌和真菌，属高分子聚合多糖，按结构可分为肽聚糖、葡聚糖和脂多糖等。它们均含有某一特有的保守结构序列，且此结构不属于高等生物体的正常组分。这些多糖具有免疫调节的功能，可能是由于高等动物非特异防御系统逐渐进化，从而识别这些微生物的保守结构[1]。

微生物多糖能够刺激吞噬细胞释放具有杀菌能力的活性氧，使溶酶体内各种活性酶的活性增强；与补体因子结合由旁路激活途径激活补体系统(complement, C)，促进吞噬细胞的吞噬活性，或通过补体系统形成的膜攻击单位(由补体成分C5~C9组成，能嵌入细胞膜的磷脂双层结构中，使细胞膜穿孔、细胞内容物渗漏)完成细胞溶解作用；刺激产生和活化NO及各种信号因子，通过信号转导活化各类免疫细胞；提高溶菌酶的活性，诱导激活超氧化物歧化酶、酚氧化酶系统等酶类。

2 葡聚糖的结构与免疫活性间的关系

免疫活性葡聚糖，多由线性β(1,3)连接的D-吡喃葡糖苷残基构成，在C6上有不同程度的支链，支链含一个或几个葡糖苷通过β(1,3)或β(1,6)糖苷键连接。该结构可能是动植物产生宿主防御的基本诱发因素，因而具有广谱免疫调节作用。

2.1 初级结构

β(1,3)葡聚糖受体可以区分多糖上的特异结构，而对同型甘露糖和β(1,6)葡聚糖均不显识别活性，由多种单糖组成的酵母多糖的识别活性也只与其中所含的β(1,3)葡聚糖有关[2]。单糖构型(α/β)是决定糖苷键定向及空间构象的关键因素，β(1,3)葡聚糖有利于分子卷曲成螺旋结构，而α(1,3)葡聚糖只形成带状结构，前者具有较强的抗癌及免疫调节活性。β(1,3)骨架结构对免疫活性是必需的，改性的β(1,3)D-葡聚糖具有较强的抗肿瘤活性，而改性的β(1,4)葡聚糖则无抗肿瘤活性[3]。

2.2 支链情况

带有(1→6)键分支的β(1,3)葡聚糖如裂褶菌多糖、小核菌多糖、香菇多糖对感染爱德华菌和嗜水气单胞菌的鲤鱼的免疫保护效果好于没有分支结构的β(1,3)葡聚糖，如细菌凝胶聚糖、海藻多糖、酵母葡聚糖[4]。高度支链化的雷丸菌多糖OL-2与中度支链化的裂裥多糖相比，在诱导宿主淋巴因子分泌特性和能力方面有差异。OL-2不但能诱导白细胞介素-1受体颉颃物基因表达，还能刺激小鼠腹腔渗出细胞合成白细胞介素-1α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α和粒巨噬细胞集落刺激因子的mRNA。相比之下，裂裥菌多糖只能诱导白细胞介素-1α与肿瘤坏死因子-α的mRNA合成，对肝、脾细胞的诱导也有差异。Bao X等[5]分离出一种含有β(1,3)连接的D-吡喃葡糖苷残基的复合多糖，具单糖、二糖和寡糖(1→6)取代侧链，分析表明侧链长度和在主链上的取代度是决定β(1,3)葡聚糖构象和生物活性的重要因素。

2.3 分子质量大小

葡聚糖的抗肿瘤和免疫调节等生物活性及药理活性，与分子大小有着明显的对应关系。大分子多糖具有较强的生物活性，但水溶性较差；能够基本保留其大分子生物活性的可溶性多糖的分子质量多介于10 ku～15 ku。聚合度降至7的β(1,3)葡聚糖仍有受体识别能力。Engstad R E等[2]认为，对受体的识别结构功能单元可降至3个葡萄糖单元水平，可能是其二级结构功能单位。用超声波破碎的方法制备葡聚糖的低分子质量衍生物(90 ku～100 ku)，具有较高的促有丝分裂活性、辐射防护活性和抗诱变活性[6]。

2.4 高级结构特性

高分子质量β(1,3)D-葡聚糖的结构高度有序，呈3股螺旋状，对免疫调节活性至关重要。许多抗肿瘤的葡聚糖都是以β(1,3)连接为主链，具有β(1,6)分支呈3股螺旋结构的大分子。3股螺旋是β(1,3)葡聚糖的一种稳态化构象，富含β(1,6)支链更易形成。由于β(1,3)葡聚糖能够形成螺旋结构，因此活性比α(1,3)葡聚糖高。

2.5 取代基的性质

葡聚糖螺旋结构外表面存在的亲水基团对其活性有重要影响。适当地将某些β(1,3)D-葡聚糖分支氧化，还原生成葡聚糖多元醇，可使抗肿瘤活性增加；多元醇侧链的完全去除会导致抗肿瘤活性的丧失[7]。羧甲基葡聚糖在小鼠中表现出潜在的抗辐射保护力和提高造血能力[8]。磺乙基葡聚糖在小鼠中具有抗重铬酸钾诱变的作用[9]。

3 肽聚糖的结构与免疫增强活性间的关系

肽聚糖是由氨基糖骨架和肽链组成的聚合物，其结构单元由β(1,4)连接的N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸二糖单位以及四肽亚单位和肽桥组成。亚肽单位及间肽桥上氨基酸组成及排列的不同，决定了肽聚糖种类的多样性。肽聚糖最小的活性单位是肽聚糖单体(二糖四肽)和胞壁酰二肽。

在Lawrence C等[10]的研究中，肽聚糖诱导产生白细胞介素-12(IL-12)的活性和其他免疫调节活性一样，有赖于其肽段部分的结构，具有L-Ala-D-Glu-m-A2pm-D-Ala和L-Ala-D-Glu(NH2) L-Lys-D-Ala的四肽结构，能诱导IL-12 mRNA的合成。用酶消化过的肽聚糖诱导产生IL-12的活性大大降低，说明肽聚糖的聚合结构是诱导IL-12 mRNA合成所必需的。肽段中前两个氨基酸基团通常是L-Ala-D-Glu，具有这样结构的肽聚糖常表现出免疫调节的活性。Chedid L等[11]在对免疫佐剂非特异性免疫增强活性的研究发现，其化学结构与抗菌活性间存在实验性关系，具抗菌活性的化合物都有相同的结构和立体化学结构，即胞壁酰二肽中所含的结构L-Ala-D-Glu。若用L-丝氨酰或L-甘氨酰残基替代了其中的L-丙氨酰残基后，化合物就仅具有佐剂活性而失去了明显的抗菌活性。L-赖氨酰残基的γ-羧基的存在使化合物具有活性，进一步用D-丙氨酰取代L-赖氨酰残基能使化合物失去抗菌活性但不失去佐剂活性。可见，抗菌活性要比佐剂活性具有更强的结构特异性。

4 脂多糖的结构与免疫增强活性间的关系

脂多糖的结构分为特异性O-抗原多糖侧链、核心寡聚糖和类脂A3部分。类脂A由磷酸化的β(1,6)D-葡糖胺二糖与脂酰基连接而成，高度保守且很难被特异性免疫系统所识别。已有报道将脂多糖用于免疫增强剂，但其免疫增强活性与化学结构间的关系的研究较少，研究较透彻的是脂多糖结构对其内毒素活性的影响。

类脂A是脂多糖内毒素的核心结构，也是使脂多糖具有生物活性的最小结构。Hashimoto M等[12]指出脂酰基链的性质、长度和数量以及二糖骨架的磷酸化状态是影响内毒素活性的主要因子。由二乙酰葡糖胺骨架、6个脂肪酸和两个磷酸组成的样品，若在其葡糖胺的还原端或非还原端缺少一个磷酸，或是缺少了两个脂肪酸，或是脂酰基链长度增长均使内毒素活性减弱。在不同位置上磷酸化和酰基化的葡糖胺单糖均缺乏活性，表明二糖骨架在体液和细胞中是受体对其识别所必需的。磷酸基团的数量、位置和水化基团间的相互作用均与类脂A的生物学活性相关[13]。从本质上说，真正影响类脂A活性的是处在恰当位置上负电荷的数量，而不是磷酸基团本身。此外，疏水的脂酰基链对诱导产生细胞因子非常关键，结构与大肠杆菌类脂A相似，仅少了几个脂肪酸分子的类脂A的活性几乎降低100%。虽然类脂A是内毒素的主要活性部分，但其所连接的糖残基部分、取代基的性质和数量也会对类脂A的活性产生一定影响。Kondakova A N等[14]研究表明，特异性的O-多糖侧链在结构上的变化会影响类脂A的生物学活性。

5 展望

微生物多糖的结构与生物学活性间关系的研究，是将其应用在水产养殖中提高水产动物非特异免疫能力的理论基础，是找到活性强而且免疫增强效果时间长的活性多糖的有效方法。针对现今在高密度水产动物养殖中流行的多种病害，尤其是大规模暴发的病毒病，进行免疫增强剂的研究意义重大。若能从预防的角度减轻水产动物病害造成的损失，其经济效益是非常可观的。虽然微生物多糖的免疫增强效果明显，且已被广泛应用，但其理论依据的研究并不深入，大部分都是依据经验来使用。微生物多糖类免疫增强剂的免疫增强效应的分子机理尚不明确，尤其是在肽聚糖和脂多糖方面非常有限，在国内还存在很多空白，仍需要大量工作的投入。

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微生物细胞壁的组成成分是天然免疫的高效活化分子，这些分子如革兰氏阴性细菌的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、革兰氏阳性细菌的肽聚糖(peptidoglycan，PGN)及真菌的β-1，3-葡聚糖(glucan)等称为病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)。PGN是由氨基糖骨架和肽链组成的聚合物，其结构单元由β-(1，4)-连接的N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸二糖单位以及四肽亚单位和肽桥组成。亚肽单位和间肽桥上氨基酸组成及排列的不同，决定了肽聚糖种类的多样性[1]。

天然免疫系统通过在进化中高度保守的一系列模式识别受体，识别微生物表面保守分子模式，其中PGRPs是一种重要的模式识别受体，在抵抗病原体入侵的过程中发挥着重要作用。PGRPs的研究始于1996年，Youshida H等在家蚕血淋巴中发现并纯化出了一种19 ku的蛋白，将其命名为PGRP。随后，学者们分别从蛾、果蝇、大鼠、小鼠和人体内成功克隆出PGRPs基因，并且在牛、骆驼、猪中也能克隆得到昆虫PGRP-S的同源基因。目前，已经鉴定出大约40种PGRPs。PGRPs在昆虫和哺乳动物中已得到一定程度研究，但仍有一些作用机理尚待探讨。

1　PGRPs基因

PGRPs家族成员有一个C端PGRP结构域，约有165个氨基酸，从昆虫到哺乳动物显示出高度的保守性。但在PGRP结构域之外，氨基酸序列差异较大。根据它们的结构，肽聚糖识别蛋白可以分为两个亚型，即长型肽聚糖识别蛋白(PGRP-L)和短型肽聚糖识别蛋白(PGRP-S)。PGRP-S是一类小分子的胞外蛋白，与原始的PGRP相似。PGRP-L是一类跨膜蛋白或胞内蛋白，其基因要比短型PGRP复杂的多，它们都有一个长的转录本，在许多情况下有几种剪接类型，不同的剪接类型编码不同的蛋白质。

果蝇有13个PGRP基因编码至少17种蛋白，其中有7种GPRP-S，10种PGRP-L。非洲按蚊有7种PGRP基因，其中有3个PGRP基因编码3种PGRP-S，4个PGRP基因编码7个PGRP-L。人PGRP家族由PGRP-L、PGRP-S、PGRP-Iα和PGRP-Iβ 4个成员组成。人类基因组组织基因命名委员会推荐分别用PGLYRP1、PGLYRP2、PGLYRP3和PGLYRP4代表PGRP-S、PGRP-L、PGRP-Iα和PGRP-Iβ。

Mathur P等[2]报道大鼠的PGRP-Iα并不是跨膜蛋白，可能是一种分泌蛋白。Zhang Y等[3]发现PGLYRP2是在肝脏中合成的，并且分泌到血液中，大部分PGLYRP2是分泌蛋白，这一结果表明PGLYRP2不是一种跨膜蛋白，这与Liu C等(2001)根据计算机分析假设的人PGLYRP2有两个跨膜域的论断是不相符的。事实上，这两个所谓的跨膜域并不是真正的跨膜域，而只是一个疏水的结构域。这个结论与Gelius E等[4]发现大鼠PGLYRP2是从细胞分泌的结果是一致的。

2　PGRPs结构

自从Kim M S等[5]用X射线晶体衍射法在20 nm下测得果蝇PGRP-LB空间结构之后，一些PGRPs的空间结构也被陆续报道。Reiser J B等[6]在15.6 nm下测得果蝇PGRP-SA的空间结构，Guan R等[7]报道了人的PGRP-Iα C端结构，Guan R等[8]在17.0 nm下测得人的PGRP-S的空间结构。这些蛋白的空间构象极为相似，均包括3个α-螺旋(α1～α3)区域，以及由5个β-折叠片形成的活性域中心，其中4个平行β-折叠片(β3，β4，β6和β7)，1个反平行β-折叠片(β5)，在N端还有两个β折叠股(β1，β2)，在空间上形成一个非常对称的花篮状结构。

 PGRPs有3个二硫键，为Cys9-Cys133，Cys25-Cys70及Cys46-Cys52，前两个键分别将PGRP特异结合部位的两个肽链连接到α2螺旋和α1-β4环上，第3个二硫键将β3-α1环连接到α1螺旋上。Cys9-Cys133存在于一些昆虫的PGRP-S中，Cys25-Cys70是哺乳动物PGRPs所特有的结构，却不存在于具有酰胺酶活性的PGRPs中，如人和鼠的PGRP-L和Cys46-Cys52存在于所有已知的PGRPs(除果蝇PGRP-LE外)中，对维持PGRPs结构域的结构完整性起着重要的作用。这些二硫键是PGRPs结构和功能所必需的。

3　PGRPs表达

昆虫的PGRP-L主要表达于血细胞，PGRP-S存在于血淋巴、表皮和内脏，在血细胞中也有少量的表达。其中有些PGRPs是组成性表达，也有一些PGRPs(主要是PGRP-L，但除了PGRP-LB以外)是诱导性表达，在细菌感染或注射PGN可上调其表达。

人的PGRPs中PGRP-L表达最广泛，除在肝和胎肝表达外，在横结肠、淋巴结、心脏、胸腺、胰、降结肠、胃和睾丸有低表达。PGRP-Iα除在食管高表达外，也在扁桃体和胸腺表达，而在胃、降结肠、直肠和脑也有极低水平表达。PGRP-Iβ仅在食管、扁桃体和胸腺中表达。PGRP-S在骨髓高表达，并在胎肝和白细胞低水平表达，在外周血中仅中性粒细胞表达。因为外周血中的中性粒细胞的“污染”作用，使PGRP-S有可能在脾和空肠中低水平表达，这可能就是导致大鼠脾中PGRP-S有低水平表达的原因。有趣的是，Rehman A等(2001)发现小鼠缺乏睡眠能够上调其PGRP的表达，这说明PGRP可能在睡眠的自我调节方面起到了一定的作用。

4　PGRPs功能

酚氧化酶原级联反应是昆虫抗菌防御的一部分，模式识别受体是酚氧化酶原激活系统的启动者，当模式识别受体与微生物细胞壁成分结合后形成一复合物，该复合物激活酚氧化酶原的激活酶原，使其成为酚氧化酶原激活酶，酚氧化酶原激活酶使酚氧化酶原激活，成为有活性的酚氧化酶。酚氧化酶是一种含铜的氧化剂，能把含酚的底物氧化成醌，再经几步非酶促反应转化为黑色素，而黑色素对微生物是有毒性的，同时酚氧化酶也参与表皮的硬化。Youshida H等最早在家蚕中发现的PGRP-S能够识别PGN和革兰氏阳性菌，并能激活酚氧化酶原级联反应，在表皮、血淋巴及组织中产生黑色素，包裹微生物从而限制感染。Takehana A等(2002)发现果蝇的PGRP-LE也能激活此级联反应。

革兰氏阳性菌通过分泌型PGRP-SA活化果蝇Toll信号通路。PGN和PGRP-SA的相互作用激活蛋白水解酶，它能水解存在于昆虫血淋巴中的一种内源性配体-Spaetzle，而Spaetzle是激活果蝇Toll信号通路的一个因子。Toll信号的活化激活了一个信号转导途径，该途径导致Dorsal和Dorsal-related immunity factor这两个转录因子的激活，活化果蝇霉素和其他抗菌肽，有效的防御革兰氏阳性菌和真菌的入侵。有些学者发现真菌通过革兰氏阴性菌结合蛋白-3也能激活此通路。

一些学者通过功能缺失技术，发现PGRP-LCa和PGRP-LCx能激活IMD信号通路，通过控制Rel家族转录因子Relish可诱导其抗菌肽的表达。也有学者根据功能获得技术，发现PGRP-LE对Dap型PGN有很强的亲和力，起着胞内或胞外识别分子的功能，活化抗菌肽，其过量表达也能激活IMD的信号通路。

Ramet M等(2002)根据RNAi技术发现抑制果蝇S-2细胞中的PGRP-LC的表达，削弱了大肠埃希菌的吞噬作用，故果蝇的PGRP-LC也可能对革兰氏阴性菌的吞噬作用中起着重要的作用，但其作用机理还有待于研究。

肽聚糖具有促炎作用，而酰胺酶消化肽聚糖能消除此活性。Mellroth P等[9]通过引入定点突变的方法，发现PGRP-SC1B具有酰胺酶活性，它能水解细菌中N-乙酰胞壁酸与L-丙氨酸之间的酰胺键，将活性的肽聚糖分子转变为没有活性的肽聚糖片断，起着肽聚糖清除分子的作用。将果蝇的PGRP-LB进行基因敲除后，发现果蝇更易感染细菌，而且由于PGN清除速度的减缓，果蝇在感染后免疫反应延长，这也说明PGRP具有肽聚糖清除分子的作用[10]。

人的PGRP-S、PGRP-Iα和PGRP-Iβ有抗菌作用，其他哺乳动物PGRPs也被报道有杀菌或抑菌活性[11-12]。Dziarski R等[13]发现大鼠的PGRP-S具有抑制革兰氏阳性菌生长的作用，PGRP-S基因敲除后的大鼠对革兰氏阳性菌的易感性增加。在人的PGRPs 4个成员中，人们只发现PGRP-L具有酰胺酶活性，人PGRP-L Cys的一个突变体能够使PGRP-L丧失酰胺酶活性[14]。Gelius E等[4]发现大鼠的PGRP-L也具有酰胺酶活性。Sashchenko L P等[15]发现大鼠PGRP-S与体液或淋巴细胞内的Hsp70能形成一个稳定的细胞毒素复合体，在极低的浓度下就能导致机体死亡。Kappeler S R等[16]发现骆驼的PGRP识别乳酸菌，在链球菌感染时能够上调其表达，但在乳腺发炎的情况下却不出现此现象，这似乎说明了在骆驼奶中这种蛋白的主要作用是抑制乳酸菌的生长。

5　PGRPs的进化

PGRP家族中PGRP-S是最古老的，而PGRP-L是最年轻的，哺乳动物PGRP-S、人PGRP-I、哺乳动物PGRP-L各形成1个独立的分支。人PGRP-I没有昆虫同源物，哺乳动物PGRP-I来自于共同的从昆虫PGRP-S分离出来后的哺乳动物PGRP-S祖先。哺乳动物PGRP-L形成一个与果蝇PGRP-L不相关的独立分支，意味着哺乳动物PGRP-L不是源自果蝇PGRP-L、哺乳动物PGRP-S或PGRP-I，而是源自一个共同的昆虫PGRP-S祖先。

6　展望

所有的肽聚糖识别蛋白能结合肽聚糖和细菌，这表明PGRP在天然免疫中具有识别和杀灭细菌的重要意义。但是尽管PGRPs被命名为肽聚糖识别蛋白，它不仅仅识别肽聚糖或革兰氏阳性菌，还能识别其他一些分子。牛的PGRP-S既对革兰氏阳性菌，又对革兰氏阴性菌甚至对一些真菌均具有杀菌或抑菌作用。果蝇的PGRP-LC和大鼠的PGRP除了能结合肽聚糖外，还能结合脂多糖。此外，人的PGRP-L，PGRP-S和PGRP-Iα有不同的结合细菌模式，但是人的PGRP-Iβ结合细菌和真菌的能力极弱，它可能对一些非细菌物质有特别的结合力，这一点还有待证明。

目前，肽聚糖识别蛋白的结构和功能在昆虫和哺乳动物中已得到一定程度的研究，但在水产养殖动物中的研究还很少，仅见于斑马鱼和海湾扇贝PGRPs基因克隆的报道。PGRPs在水产养殖动物中的研究势在必行，这有利于更好的揭示天然免疫作用的途径。总之，PGRPs蛋白家族在免疫反应中发挥重要的作用，对该蛋白家族的研究有助于更深入彻底的了解免疫系统及其工作机制。

韦嵩　 宋晓玲　 李谮　 李海兵  动物医学进展   2007 Vol.28 No.1 P.61-64

参考文献

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不同酶解方式对肽聚糖制剂生物学活性的影响

张悦　 宋晓玲　 黄倢　 韦嵩　

摘　要：将经过不同酶解方式处理的肽聚糖制剂配制成饲料投喂凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei),测定不同肽聚糖对对虾血清酚氧化酶和酸性磷酸酶的影响并分析不同酶解处理组肽聚糖制剂中的成分及其含量.肽聚糖制剂成分分析结果显示,经72 h溶菌酶水解的肽聚糖制剂的低分子量肽聚糖含量较经过24 h水解的肽聚糖制剂高,且蛋白酶的水解作用可促进溶菌酶的水解作用.对虾血清酶活力结果显示,对于提高对虾的酚氧化酶及酸性磷酸酶活力,酶解后的肽聚糖制剂比未经酶解的肽聚糖制剂效果明显,且含有较多低分子量肽聚糖的制剂组的效果优于含有较少低分子量肽聚糖的制剂组.实验结果表明,肽聚糖的免疫增强活性与肽聚糖分子量的大小相关,肽聚糖制剂中低聚糖含量的增加会提高其免疫增强效果.
关键词：肽聚糖;酶解;凡纳滨对虾;酚氧化酶;酸性磷酸酶

中国水产科学 2006 Vol.13 No.4 P.631-636